Estudio de EhMRE11 y su participación en la vía ALT en Entamoeba histolytica

Abstract

Los telómeros son complejos de nucleoproteínas especializadas que protegen los extremos de los cromosomas lineales de eucariotas de la degradación y de su reconocimiento como daño al DNA. Los telómeros pueden cambiar entre estados cerrados (protegidos) o abiertos (en replicación) durante el ciclo celular. Cada estado se rige por una serie de interacciones con factores específicos que pueden conducir a la célula a división celular, senescencia o apoptosis en condiciones normales o en trastornos como el cáncer. Dentro de estos factores se encuentra el complejo MRN (MRE11-RAD50-NBS1) el cual se localiza en los telómeros durante las fases S y G2 del ciclo celular. Este complejo interacciona directamente con proteínas de unión a los repetidos teloméricos (TRF’s) contribuyendo a la formación de la hebra líder rica en G. Así mismo, se ha encontrado que el complejo MRN es necesario para el alargamiento de los telómeros mediado por la vía Alternativa de Mantenimiento Telomérico (vía ALT). La vía ALT se encuentra presente en células deficientes de telomerasa y dependiente de la recombinación homóloga. En células donde la vía ALT se encuentra activa, se ha detectado al complejo MRN en los cuerpos APB, los cuales son agregados nucleares de proteínas, DNA telomérico y cromatina. Diversos estudios en Entamoeba histolytica han demostrado la expresión de genes involucrados en la HR como mre11. Además, este parásito se caracteriza por la ausencia de la enzima telomerasa dentro de su genoma; sin embargo, se han encontrado genes que codifican para tres proteínas similares a las TRF´s de Homo sapiens, como EhTRF-like I, EhTRF-like II y EhTRF-like III. Por lo tanto, en este trabajo se estudió la presencia de la vía ALT en el protozoario E. histolytica, mediante el estudio de la expresión y localización de la proteína MRE11 involucrada en la HR. Mediante un análisis in silico se identificaron 51 de los 59 genes descritos para la vía ALT en este parásito. Así mismo, por medio de microscopia confocal se evidenció la co-localización de la proteína EhMRE11 con las proteínas EhTRF-like I y EhTRF-like III, confirmando su presencia en regiones nucleares que podrían corresponder a posibles cuerpos APB. La sensibilidad al inhibidor VE-821 se ha empleado para estudiar la vía ALT, es por ello que en este trabajo se determinó la IC50 para E. histolytica, la cual fue 9.7 M en contraste con 0.5 M de la linea celular Saos-2 (vía ALT positiva) y 6.5 M en células HeLa (vía ALT negativa). Finalmente, se analizó el efecto del inhibidor específico de ATR, VE-821 en trofozoítos de E. histolytica y en la co-localización de las EhMRE11 con EhTRF-like I y EhTRF-like III. Nuestros resultados sugieren que el mantenimiento telomérico de este parásito podría llevarse a cabo mediante la vía ALT. / Telomeres are specialized nucleoprotein complexes that protect the ends of linear eukaryotic chromosomes from degradation and their recognition as DNA damage. Telomeres can change between closed (protected) or open (in replication) states during the cell cycle. Each state is governed by a series of interactions with specific factors and can lead the cell to cell division or senescence, apoptosis under normal conditions or disorders such as cancer. One of these factors is the MRN complex (MRE11-RAD50-NBS1) which is located in the telomeres during the S and G2 phase of the cell cycle through direct interaction with Telomere repeat binding factor (TRFs proteins), contributing to the formation of the leader strand rich in G. The ALT pathway is present in telomerase deficient cells in which maintenance of telomeres is dependent on homologous recombination. In cells with ALT pathway, the MRN complex has been detected in the APB bodies, which are nuclear aggregates of proteins, telomeric DNA and chromatin. Several studies in Entamoeba histolytica have demonstrated the expression of genes involved in HR (MRE11, among others). In addition this parasite is characterized by the absence of the enzyme telomerase within its genome, however interestingly genes encoding for three proteins similar to Homo sapiens TRF's have been found, dubbed as EhTRF-like I, II and III. Therefore, in this work we studied the presence of the ALT pathway through the MRE11 protein. Initially we performed an in silico survey to search for the genes involved in the ALT pathway, in this parasite we identified 51 of the 59 that have been described for H. sapiens. The subcellular colocalization of the EhMRE11 protein with EhTRF-like I and EhTRF-like III was evidenced by confocal microscopy, confirming its presence in nuclear regions that could correspond to possible APB bodies. The sensitivity to the VE-821 inhibitor has been used to study the ALT pathway, in this work the IC50 for E. histolytica was determined obtaining 9.7 M in contrast to 0.5 M of the Saos-2 cell line ( positive ALT pathway) and 6.5 M in HeLa cells (negative ALT pathway). Finally, we analyzed the effect of the specific inhibitor of ATR, VE-821 in the trophozoites of E. histolytica and in the colocalization of the EhMRE11, EhTRF-like I and EhTRF-like III proteins. Our results suggest that telomeric maintenance of this parasite could be carried out through the ALT pathway.