Efecto del cultivo en tres dimensiones (3d) Organotipico en el transcriptoma de ARNm y la respuesta a la terapia farmacológica en células de cáncer de mama Her2+

Abstract

RESUMEN:

Los tumores mamarios malignos HER2+, constiyuyen un tipo de cáncer de mama (CM) que se caracteriza por la amplificación del gen que codifica para esta proteína. HER2 es una oncoproteína que participa en la regulación del crecimiento, la supervivencia y la diferenciación celular (Iqbal, 2014). Aunque, las terapias anticancerígenas van dirigidas dependiendo las características moleculares del tumor, las pacientes eventualmente se vuelven resistentes al tratamiento (Gottesman M, 2002). Actualmente, se ha demostrado que los cultivos 3D emulan mejor las características de los tumores formados en condiciones fisiológicas, debido a esto se utilizaron como modelo de estudios en este proyecto. El objetivo de este trabajo fue comparar la expresión diferencial de una línea celular de CM HER2+ en dos tipos de condiciones de cultivo; un modelo tradicional en monocapa y un cultivo tridimensional (3D), nuestra hipótesis es que este último tenga un perfil transcripcional más allegado al de un tumor in-vivo. y por lo tanto pueda estar expresando genes que le confieran resistencia a la terapia farmacológica. Primeramente, se realizó un ensayo de microarreglos para evaluar la expresión diferencial de ARNm en ambos tipos de cultivo. Los datos muestran que 2870 genes fueron sobreexpresados y 1943 reprimidos en las células crecidas en 3D en comparación con los cultivos en 2D. El análisis bioinformático identificó genes asociados a la resistencia a quimioterapia, que se sobreexpresaron en la condición 3D con respecto a 2D, resaltando el papel de algunos transportadores tipo ABC. Nuestros análisis posteriores identificaron al transportador ABCB10 como un candidato potencial para análisis funcionales. Se diseñaron primers para validar su expresión en cultivos 2D y 3D y se confirmó su sobreexpresión en 3D, posteriormente se utilizó un siRNA específico para disminuir la expresión del gen y evaluar su efecto en la sensibilización de las células de CM al tratamiento quimioterapéutico in-vitro. Se determinó la IC50 de la línea celular para el tratamiento con cisplatino y se observó que la viabilidad celular disminuía en las células transfectadas con el siRNA para ABCB10 y tratadas con cisplatino en comparación con aquellas que no fueron transfectadas pero sí tratadas con cisplatino. Estos datos muestran que el crecimiento de las células de CM en condiciones 3D impactan fuertemente el transcriptoma de ARNm y permiten la identificación de potenciales blanco terapéuticos asociados a la resistencia a la terapia.

ABSTRACT:

HER2+ malignant breast tumors constitute a type of breast cancer (BC) that is characterized by the amplification of the gene that codes for this protein. HER2 is a oncoprotein that participates in the regulation of cell growth, survival, and differentiation. Although anticancer therapies are targeted depending on the molecular characteristics of the tumor, patients eventually become resistant of treatment (Gottesman M, 2002). Currently, it has been showed that 3D cultures better emulate the characteristics of tumors formed under physiological conditions, which they were used as study model in this project. The aim of this work was to compare differential expression of HER2 BC cell line in two types of culture conditions: a monolayer model and three-dimensional (3D) culture. Our hypothesis is that the latter has a transcriptional profile closer to that of an in-vivo tumor and therefore may be expressing genes that confer resistance to pharmacological therapy. First, a microarray assay was performed to evaluate the differential expression of mRNA in both types of culture. The data show that 2870 genes were overexpressed and 1943 down expressed in cells grown in 3D compared to 2D cultures. The bioinformatic analysis identified genes associated with resistance to chemotherapy, which were overexpressed in the 3D condition compared to 2D, highlighting the role of some ABC transporters. Our subsequent analyzes identified that ABCB10 transporter as a potential candidate for functional analyses. Primers were designed to validate its expression in 2D and 3D cultures and its overexpression was confirmed in 3D. Subsequently a specific siRNA was used to decrease the expression of the gene and evaluate its effect on the sensitization of BC cells to in-vitro chemotherapeutic treatment. The IC50 of the cell line for treatment with cisplatin was determined and it was observed that cell viability decreased in cells transfected with the siRNA for ABCB10 and treated with cisplatin. These data show that the growth cells of BC in 3D conditions strongly impacts the mRNA transcriptome and allows the identification of potential therapeutic targets associated with therapy resistance.