Evaluación de los ejes hsa-miR-372/ARID4B/ARID4B, hsa-miR-372/GALNT3/GALNT3 y hsa-miR- 372/KPNA6/KPNA6 en la línea celular NTERA-2 cl-D1 y su correlación con muestras de pacientes con tumor testicular de células germinales

Abstract

Resumen: "La Criptorquidia (CO) o no descenso testicular es la malformación urológica más frecuente en edades pediátricas y es uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo del tumor testicular de células germinales (TTCG) en la adultez. Se ha propuesto que los microRNAs (miRNAs) en particular el clúster hsa-miR-371-373, participan en la tumorogenesis testicular al favorecer la proliferación y el mantenimiento del estado pluripotente en las células germinales. Dentro de este clústerse encuentra el hsa-miR-372, el cual se ha identificado como un oncogén que inhibe la vía de p53 mediante la represión de LATS2. En este trabajo se evaluaron los ejes hsa-miR372/ARID4B/ARID4B, hsa-miR372/GALNT3/GALNT3 y hsa-miR372/KPNA6/KPNA6, en muestras de pacientes con TTCG con el objetivo de analizar su posible correlación con las características clínico-patológicas de los pacientes mediante RT-qPCR, inmunohistoquimica y la correlación de Spearman, sumado a la modulación del hsa-miR-372 en la línea celular NT2/D1 para observar su efecto sobre los transcritos y los productos proteicos de ARID4B, GALNT3 y KPNA6 mediante RT-qPCR y Western blot. En el grupo con TTCG se identificó una sobreexpresión significativa del hsa-miR- 372 y una disminución de los transcritos ARID4B, GALNT3 y KPNA6 respecto al grupo control aunque no se encontraron diferencias significativas entre los niveles de expresión de los 4 transcritos con las características clínicas se encontraron correlaciones positivas entre la expresión de GALNT3 y KPNA6, especialmente en las correlaciones de los grupos con TTCG del tipo no seminoma (nsTTCG) y el grupo en estadio I, sugiriendo una participación conjunta en la tumorogénesis. La inmunorreacción para Vimentina mostró una pérdida de la estructura testicular en las muestras con TTCG, mientras que para GALNT3 sólo el 29.16% (7/24) de las muestras mostró inmunorreactividad, mientras que no se mostró para ARID4B y KPNA6. La expresión anormal de GALNT3 podría asociarse con alteraciones en células de Sertoli en etapas tempranas; así como, en la glicosilación, el transporte nuclear y la remodelación de la cromatina. Tras la modulación del hsa-miR-372 en la línea celular NT2/D1 se confirmó su impacto sobre GALNT3 observando un aumento del transcrito y de la proteína al inhibir el miRNA. En conclusión, estos datos respaldan la hipótesis de que la modulación del hsa-miR-372 afecta sólo los niveles de expresión del eje GALNT3/GALNT3 en la línea celular NTERA-2 de TTCG, lo que concuerda con los niveles de expresión identificados para el eje hsa-miR- 372/GALNT3/ GALNT3 en muestras de pacientes con TTCG".

Abstract: "Cryptorchidism (CO) or undescended testicles is the most common urological malformation in childhood and is one of the main risk factors for the development of testicular germ-cell tumors (TGCTs) in adulthood. It has been proposed that microRNAs (miRNAs), particularly the hsa-miR-371-373 cluster, play an important role in testicular tumorigenesis by promoting proliferation and maintaining the pluripotent state in germ- cells. As part of this cluster is hsa-miR-372, which has been described as an oncogene that inhibits the p53 pathway by repressing LATS2. For this study, the expressions of the hsa-miR372/ARID4B/ARID4B, hsa-miR372/ GALNT3/GALNT3, and hsa-miR372/KPNA6/KPNA6 axes were evaluated in samples from patients with TGCT by RT-qPCR, immunohistochemistry, and Spearman correlation. Subsequently, the correlation between expression levels and the patients' clinicopathological characteristics was assessed. Finally, hsa-miR-372 expression was modulated in the NT2/D1 cell line to determine its effect on the gene expression of ARID4B, GALNT3, and KPNA6 and their protein products by RT-qPCR and Western blot. The TGCT group showed significant overexpression of hsa-miR-372 and underexpression of the ARID4B, GALNT3, and KPNA6 transcripts compared to the control group. Although no significant differences were found between the expression levels of the four transcripts and the different clinical characteristics of TGCT, positive correlations were found between the expression of GALNT3 and KPNA6, especially for seminomatous and non-seminomatous TGCT, as well as for clinical stage I, suggesting a joint role in tumorigenesis. Immunohistochemical analysis for vimentin showed a loss of testicular structure in the TGCT-positive samples, while for GALNT3 only 29.16% (7/24) of the samples showed immunoreactivity, whereas no immunoreactivity was observed for ARID4B and KPNA6. Abnormal GALNT3 expression could be associated with alterations in Sertoli cells at early stages, as well as in glycosylation, nuclear transport, and chromatin remodeling. After modulation of hsa-miR-372 in the NT2/D1 cell line, its impact on GALNT3 expression was confirmed by observing an increase in transcript and protein when miRNA was inhibited. In conclusion, these data support the hypothesis that modulation of hsa-miR-372 affects only the expression levels of the GALNT3/GALNT3 axis in the NTERA-2 cell line of TGCT, which is consistent with the expression levels identified for the hsa-miR- 372/GALNT3/GALNT3 axis in samples from TGCT patients".