“Estudio de la diversidad génica en diversos aislados de Anaplasma marginale”

Abstract

"ABSTRACT Bovine Anaplasmosis is a disease with a high economical impact on the cattle industry at different geographic regions. Even though several strategies have been developed to control the disease, they have been unable to generate protection against the high heterogeneity of strains. At endemic regions ≥ 70% of the animals are in risk of being infected by Anaplasma marginale. The disease persistence is maintained by generation of multiple antigenic variants that evade the host immune response. These variants are generated by segmental gene conversions between the msp2 expression site and msp2 pseudogenes that are located across the genome. A. marginale strains differ at sequence level as well as the amount of pseudogenes distributed in the genome (7 to 9). The difference between msp2 repertoires allows the establishment of superinfection only when a second infecting strain expresses a different msp2 allele repertoire. The new variants of the repertoires will be able to avoid the immune response mounted against the strain that established the first infection. In this study we analyzed the molecular marker MSP1a to determine the circulating genotypes in the herds. More than 50% of the samples were superinfected with 2 or more genotypes of A. marginale. By considering the sequence of MSP1a tandem repeat we identified a dominant isolate (composed by the repeats NR14/10/15). By sequencing a region of the msp2 gene we obtained several sequences and considering their frequencies, we identified 7 alleles that could represent the dominant isolated pseudogene repertoire. Even though we found 2 common alleles between the 3 analyzed samples, the pseudogen repertoire couldn’t be verified with other samples that were also infected with the dominant genotype. All msp2 obtained variants were analyzed to identify microdomain sequences and they were compared with previously reported variants. This analysis allowed us to identify shared sequences between strains. Based on the St. Maries MSP2 alleles sequences we synthesized peptides to determine if there were differences or not in the epitope recognition using serum obtained from infected bovines with different A. marginale isolates. Surprisingly the antibodies in the samples displayed a very different recognition pattern, even thought the tested serums were infected with the dominant isolate. In conclusion with these results we identified new variants of MSP1a and MSP2 and correlate the superinfection event with prevalence and the presence of tick vectors. RESUMEN La Anaplasmosis bovina es una enfermedad que genera estragos millonarios en el sector ganadero de diferentes regiones del mundo. A pesar de múltiples esfuerzos realizados para controlar a esta enfermedad ha sido imposible desarrollar una estrategia que resulte completamente efectiva para proteger contra la amplia diversidad de cepas distribuidas en diferentes regiones geográficas. En regiones en donde la enfermedad es endémicas ≥70% de los animales se encuentran en riesgo de contraer la infección. La persistencia de la enfermedad es mantenida mediante la expresión de múltiples variantes antigénicas que permiten evadir la respuesta inmune del hospedero. Estas variantes se generan mediante mecanismos de conversión génica de segmentos que se llevan a cabo entre un sitio único de expresión de msp2 y el conjunto de pseudogenes msp2. Diferentes cepas de A. marginale presentan variaciones tanto a nivel de secuencia como en la cantidad de los pseudogenes que se encuentran dispersos en el genoma (de 7 a 9). La diferencia entre el repertorio msp2 permite establecer superinfecciones en los animales. Cuando una cepa contiene alelos diferentes a los de la cepa que estableció la primera infección en el hospedero, esta será capaz de evadir la respuesta previamente generada por las variantes reconocidas por el sistema inmune. En el presente trabajo utilizamos la secuencia del marcador molecular MSP1a para identificar los genotipos de los aislados que se encontraban estableciendo la infección en dos hatos nacionales. Entre las muestras analizadas identificamos que ≥ 50% de los animales estaban superinfectados con 2 o más genotipos de la A. marginale. Con base en esta secuencia MSP1a se identificó un aislado dominante (constituido por los repetidos NR14/10/15) entre las muestras analizadas. Posteriormente múltiples secuencias del gen msp2 se obtuvieron mediante secuenciación y con base en la frecuencia de cada una de las variantes obtenidas, se identificaron 7 alelos que probablemente representan el repertorio de pseudogenes del aislado dominante. A pesar de que se encontraron 2 alelos en común entre 3 de las muestras analizadas, el repertorio de pseudogenes no pudo ser corroborado en su totalidad basándonos en las variantes obtenidas de otras muestras. Las variantes de msp2 se analizaron para identificar los microdominios y compararlos con variantes previamente reportadas, lo que nos permitió identificar secuencias en común con otros aislados. Posteriormente, basándonos en la secuencia de los alelos de MSP2 de la cepa St. Maries se sintetizaron péptidos para identificar similitudes o diferencias en el reconocimiento de epítopos mediante la interacción con sueros de bovinos infectados con distintos aislados de esta bacteria. Sorpresivamente los anticuerpos presentes en las muestras presentaron patrones de reconocimiento muy diferentes a pesar de tener en común la infección con el aislado dominante. En conclusión nuestros hallazgos nos han permitido identificar nuevas variantes de MSP1a y MSP2 y de esta forma se correlacionó el establecimiento de la superinfección con la prevalencia de la infección y la presencia de vectores".