Análisis de las rutas de señalización VEGF/PI3K/AKT en la inhibición del mimetismo vasculogénico mediada por el miR-204 en cáncer de mama

Abstract

"RESUMEN: El mimetismo vasculogénico (MV) es un novedoso mecanismo independiente de la angiogénesis, en el que las células tumorales altamente agresivas y metastásicas forman estructuras tipo capilar para la obtención de nutrientes, sin el requerimiento de la angiogénesis clásica. El MV se ha asociado con un mal pronóstico y baja sobrevivencia en diversos tipos de tumores. Previamente, nuestro grupo de trabajo demostró que el miR-204 es un supresor de tumor, y un novedoso angiomiR con un papel primordial en la angiogénesis tumoral. Sin embargo, su participación en la regulación del MV aún no está explorada. En la presente investigación demostramos que las células de cáncer de mama triple negativo altamente metastásicas bajo condiciones de hipoxia desarrollan MV. Además, la restauración de la expresión del miR-204 inhibe drásticamente el MV. Con el fin de descifrar las vías de señalización implicadas en la inhibición del MV por miR-204, determinamos los niveles de expresión y el estado de fosforilación de múltiples proteínas de señalización utilizando un fosfo-arreglo de anticuerpos. Los datos mostraron que proteínas claves de múltiples vías de señalización tales como PI3K-AKT, MAPK, FAK fueron reprimidas significativamente después de la restauración de miR-204. Además, el estado de fosforilación de AKT (Ser 473), MEK1 (Ser 218/222), p38αMAPK (Thr 180/Tyr 182), PI3K (Tyr 458) y Src (Tyr 418) disminuyó, esto fue confirmado por medio de ensayos de Western blot. Interesantemente, la proteína HIF-1 que regula rio abajo la vía de señalización PI3K/AKT, también disminuyó su expresión al restaurar la expresión del miR-204. De forma congruente, la inhibición de PI3K, FAK y SRC con inhibidores específicos inhibió eficazmente el MV. Y el ensayo de luciferasa mostro que PI3K y Src son blancos del miR-204. Estos datos resaltaron la importancia de las terapias multi-focalizadas utilizando miRNAs como un enfoque atractivo en el cáncer. También nuestros hallazgos proporcionan nuevos blancos potenciales para la intervención del MV con aplicaciones terapéuticas en el cáncer de mama. ABSTRACT Vascular mimicry (VM) is a novel angiogenesis-independent mechanism in which highly aggressive and metastatic epithelial tumor cells form vascular 3D channel-like structures to obtain nutrients without the use of classical blood vessels. VM is associated with poor prognosis and low survival in diverse types of human cancers. Previously, we showed that tumor suppressor miR-204 is a novel angiomiR with a pivotal role in tumor angiogenesis. However its function in VM remains unexplored. Here, we showed that metastatic triple negative breast cancer cells effectively undergo VM in hypoxia conditions. Moreover, in vitro restoration of miR-204 using RNA mimics dramatically inhibits VM. In order to decipher the signaling circuitry involved in VM inhibition by miR-204, we screened the expression levels and phosphorylation status of multiple signaling proteins using Phospho Antibody Arrays. Data showed that a signaling network of key proteins involved in the activation of PI3K-AKT, RAF1, MAPK, and FAK pathways were significantly downregulated after restoration of miR-204. In addition, a decrease in the phosphorylation of AKT (Ser 473), MEK1 (Ser 218/222), p38αMAPK (Thr 180/Tyr 182), PI3K (Tyr 458) and Src (Tyr 418), were confirmed by Western blot. Congruently, targeted inhibition of PI3K, FAK and SRC tyrosine kinases before miR-204 restoration effectively inhibits VM. Luciferase reporter assay confirms that PI3K and SRC genes are targets of miR-204. These data highlighted the importance of RNA-based multi-targeted therapies as an attractive approach in cancer. Also our findings provide novel potential targets for VM intervention with therapeutic applications in breast cancer".