IDENTIFICACIÓN DE METALOPROTEINASAS DE Tritrichomonas foetus INVOLUCRADAS EN LA INTERACCIÓN CON LAS CÉLULAS MDBK

Abstract

RESUMEN El parásito protozoario flagelado Tritrichomonas foetus (T. foetus) es el agente causal de la tricomoniasis genital bovina, los machos son asintomáticos mientras que en las vacas, la infección varía de una vaginitis leve o cervicitis, endometritis, aborto e infertilidad. La tricomonosis bovina crea pérdidas económicas significativas ya que reduce desde el 12 hasta el 50% la producción de leche y carne. T. foetus, para establecer la infección en el ganado, requiere adhesión celular seguida de eventos de citopatogenicidad involucrados en la degradación de las células epiteliales vaginales de la mucosa del bovino. En este segundo evento, podrían estar involucradas las proteasas, que facilitan la infección y la propagación a través de los tejidos del huésped, así como la evasión del sistema inmune. Los estudios transcriptómicos demostraron que las metaloproteinasas de T. foetus son las que ocupan el tercer lugar en la expresión de las proteasas totales de este patógeno. Curiosamente, no hay estudios de metaloproteinasas involucradas en la interacción con las células bovinas. El objetivo de este trabajo fue determinar las metaloproteinasas con afinidad hacia las células MDBK. Para esto, llevamos a cabo un ensayo de ligando-proteinasa utilizando lisados totales de T. foetus e interaccionándolo con células MDBK fijadas. La actividad proteolítica de las proteinasas en interacción con la célula blanco se analizó en geles de poliacrilamida coopolimerizadas con gelatina encontrando proteinasas con pesos moleculares entre 30-150 kDa. Con la finalidad de determinar el tipo de proteinasas con afinidad a la célula blanco se utilizaron inhibidores: 1-10 fenantrolina, EDTA y EGTA, encontrándose que la actividad proteolítica era de metaloproteinasas. Posteriormente, se identificó una de las bandas con actividad proteolítica la cual se cortó y se identificó por espectrometría de masas, correspondiendo a una metaloproteinasa de 69 kDa que llamamos TF69, perteneciente a la familia M1, la cual utiliza el ión Zn2+, el sitio catalítico donde se lleva a cabo la unión con su sustrato tiene los siguientes aminoácidos HEHEY. Finalmente se analizó la expresión del transcrito del gen que codifica para TF69 encontrando que se expresa antes y durante la interacción con las células MDBK, siendo inespecífica esta afinidad dado que también se expresa al contacto con las células HeLa. ABSTRACT Tritrichomonas foetus (T. foetus) is a flagellated protozoan parasite that causes bovine trichomonosis, the males are asymptomatic while in cows, the infection varies from mild vaginitis or cervicitis, endometritis, abortion, and infertility. Bovine trichomonosis generates economical losses related with milk and meat productions affecting from 12 to 50%. T. foetus, to establish infection in cattle, requires cell adhesion followed by cytopathogenicity events involved in mucosal and bovine vaginal epithelial cells degradation. In this second event, proteases could be involved, which facilitate infection and spread through host tissues, as well as evasion of the immune system. Transcriptomic studies showed that T. foetus metalloproteinases are in the third place of expression from total proteases of this parasite. Interestingly, until now there are not studies of metalloproteases involved in the interaction toward to the bovine cells. The aim of this work was to identify metalloproteinases with affinity toward the target cell (MDBK). For this, we carried out the ligand-proteinase assay using total lysates in interaction with the MDBK cells. The metalloproteinase activity was analyzed by polyacrylamide gel co-polymerized with gelatin. The results showed activity bands in the molecular weigth between 30-150kDa. In order to determinate the metalloproteinase type, we performed the ligand-proteinase assay in presence of the inhibitors such as : 1-10 phenanthroline, EDTA and EGTA, the data showed that the major proteolytic activity was from metalloproteinases. After, one of the bands with proteolytic activity was cut and identified by mass spectrometry, corresponding to a 69 kDa metalloproteinase, we called it TF69, belonging to the M1 family, which uses the Zn2+ ion, and the catalytic site for the bind to substrate has the HEHEY amino acids. Finally, the expression of the gene coding for TF69 was analyzed during the interaction with the MDBK cells, the results showed that it is expressed before and during the interaction with MDBK cells, however,this interaction is non-specific with the MDBK cells because it is also expressed to the contact with HeLa cells.