EhTRF-like I: Predicción de su estructura y análisis de sus interacciones funcionales

Abstract

RESUMEN: "Los telómeros son complejos de protección altamente regulados y dinámicos en los extremos de los cromosomas, que consisten en repeticiones cortas en tándem de DNA y proteínas asociadas. Los factores de unión a repetidos teloméricos 1 y 2 (TRF1 y TRF2), son proteínas esenciales para el mantenimiento telomérico que tienen una arquitectura definida por dos dominios: un dominio TRFH conformado por una estructura de nueve alfa-hélices y un dominio de unión a DNA (MDBD) identificado por su similitud de secuencia con el motivo de unión a DNA de tipo Myb. Entamoeba histolytica contiene tres genes que codifican para proteínas similares a TRF1 y TRF2, las cuales fueron denominadas EhTRF-like I, II y III. En este trabajo, mediante análisis bioinformáticos analizamos la estructura tridimensional de los dominios TRFH y MDBD de la proteína EhTRF-like I. También, estudiamos la afinidad de unión de EhTRF-like I a secuencias tipo STR de Entamoeba histolytica mediante ensayos EMSA y realizamos una búsqueda de proteínas asociadas a esta proteína que pudieran estar participando en la maquinaria telomérica de este parásito a través de ensayos de tipo pull down. Nuestros resultados muestran la presencia de residuos de aminoácidos hidrofóbicos en el dominio TRFH, los cuales podrían ser parte de la superficie de interacción del dominio, posiblemente mediando las interacciones proteína-proteína que se requieren para formar tanto homodímeros como complejos de la maquinaria telomérica. Por otro lado, se confirmó que el dominio Myb de unión a DNA (MDBD) tiene una estructura hélice vuelta hélice altamente conservada. También, se determinó la afinidad de unión de la proteína rEhTRF-like I con la secuencia canónica humana la cual mostró una Kd de 6.8 nM mientras que a la secuencia tipo STR de la unidad NK2 de E. histolytica mostró una Kd de 2.9 nM. Finalmente, se identificó como socio de interacción de la proteína rEhTRF-like I a la proteína EhTRF-like II entre otras, lo que podría sugerir que son proteínas necesarias para proteger los extremos de los cromosomas del parásito". Abstract Telomeres are highly regulated and dynamic complexes at the ends of the chromosomes, which consist of short tandem repeats of DNA and associated proteins. The telomeric repeat binding factors 1 and 2 (TRF1 and TRF2), are essential proteins for telomeric maintenance that have an architecture composed by two domains: the TRFH domain consisting of a structure of nine alpha-helices and a DNA binding domain (MDBD) with a sequence similarity with the MYB DNA binding domain. Entamoeba histolytica contains three genes that encode for proteins similar to TRF1 and TRF2, which were dubbed as EhTRF-like I, II and III. In this work, through bioinformatic analysis we obtained the three-dimensional structure of the TRFH and MDBD domains of EhTRF-like I. Also, we determined the binding affinity constant of the rEhTRF-like I to the STRs sequences of E. histolytica and to the canonical TRF sequence by EMSA assays. We also perform Pull Down assays to determine proteins associated to rEhTRF-like I that could be participating in the telomeric machinery of this parasite. Our results showed the presence of hydrophobic amino acid residues which could be part of the interaction surface of the TRFH domain, possibly mediating the protein-protein interactions that are required to form both homodimers and complexes of telomeric machinery. On the other hand, it was confirmed that the MDBD domain is highly conserved. Also, the binding affinity of the rEhTRF-like I protein with the human canonical sequence was determined showing a Kd of 6.8 nM while the STR type sequence of the NK2 unit of E. histolytica showed a Kd of 2.9. nM. Finally, it was identified EhTRF-like II as an interaction partner of rEhTRF-like I protein, which could suggest that they are necessary to protect the ends of the chromosomes in this parasite.